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活性氧ROS檢測原理及檢測步驟

更新時(shí)間:2024-08-09      點(diǎn)擊次數(shù):278

ROS也叫活性氧(reactive oxygen species)是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的一種具有氧化活性的化學(xué)物質(zhì),包括過氧化氫、超氧陰離子等。ROS在正常生理?xiàng)l件下也會產(chǎn)生,但當(dāng)其產(chǎn)生過多或清除不足時(shí),會對細(xì)胞造成氧化應(yīng)激,導(dǎo)致細(xì)胞損傷和疾病發(fā)生。

檢測原理

用于檢測細(xì)胞內(nèi)ROS廣泛采用的方法是DCFH-DA熒光探針法。DCFH-DA(二氯熒光黃雙乙酸鹽)是一種可指示的探針,其本身不具有熒光,但可以自由穿過細(xì)胞膜。一旦進(jìn)入細(xì)胞,它會被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解成DCFH。由于DCFH無法穿過細(xì)胞膜,因此熒光探針會在細(xì)胞內(nèi)積聚。細(xì)胞內(nèi)的ROS能夠氧化無熒光的DCFH,生成有熒光的DCF,且熒光強(qiáng)度與ROS水平成正比。通過熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀或激光共聚焦顯微鏡等設(shè)備,在最大激發(fā)波長480nm和最大發(fā)射波長525nm下檢測熒光

檢測步驟

一、裝載探針

刺激時(shí)間較短(通常為2 h以內(nèi))的細(xì)胞:先裝載探針,后用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞。

刺激時(shí)間較長(通常為6 h以上)的細(xì)胞:先用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞,后裝載探針。

1、原位裝載探針(僅適用于貼壁細(xì)胞)

活性氧ROS檢測原理及檢測步驟

2、收集細(xì)胞后裝載探針(適用于貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞)

活性氧ROS檢測原理及檢測步驟

二、檢測

原位裝載探針法:激光共聚焦顯微鏡直接觀察,或收集細(xì)胞后用熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測。

收集細(xì)胞后裝載探針:用熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測,也可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察。

注意事項(xiàng)

① 探針裝載后,一定要洗凈殘余的未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的探針,否則會導(dǎo)致背景較高。

② 探針裝載完畢并洗凈殘余探針后,可以進(jìn)行激發(fā)波長的掃描和發(fā)射波長的掃描,以確認(rèn)探針的裝載情況是否

良好。

③ 盡量縮短探針裝載后到測定所用的時(shí)間(刺激時(shí)間除外),以減少各種可能的誤差。

④ 根據(jù)結(jié)果顯示的整體熒光強(qiáng)度的高低,可以適當(dāng)調(diào)整DCFH-DA探針的稀釋倍數(shù)以及孵育時(shí)間。


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